Ingegneria Genetica

DNA ricombinante

Con l’ingegneria genetica si è arrivati a creare un DNA ricombinante, cioè un genoma che ha parti di due DNA diversi.

Per ottenerlo ci sono più fasi:

1. deve essere estratto il DNA
2. deve essere diviso il DNA dall’RNA e dagli istoni non codificati
3. il DNA ottenuto deve essere tagliato per prendere la parte necessaria: come? Ci sono enzimi che tagliano i legami covalenti tra i nucleotidi. Si usava la DNAasi ma essa non era controllabile. Allora si è passato a usare degli enzimi di restrizione, anche detti forbici molecolari. Questi riconoscono precise sequenze di basi dopo le quali tagliano. Ce ne sono numerosissimi (più di 200) e prendono nomi diversi a seconda della sequenza che tagliano. Le parti divise dall’enzima vengono definite estremità appiccicose,e sono sempre complementari (non sono per forza lineari, possono anche essere sfalsate nei due filamenti.) Gli enzimi di restrizione si possono trovare nei batteri, infatti questi ultimi li usano per attaccare e demolire il DNA dei virus che infettano i batteri. Questi enzimi riescono a riconoscere quale DNA attaccare (virus) e quale no (batterio) grazie a gruppi metilici CH³ sul DNA batterico.

• Ora che ho tagliato la parte interessata, devo unirla ad un altro DNA. Per fare ciò è abbastanza trovare l’estremità appiccicosa complementare nell’altro DNA (ottenuta con lo stesso enzima di restrizione) e avvicinare le due estremità. Avvicinandole si ricreano i ponti idrogeno, grazie alla DNA ligasi, e si ricrea il doppio filamento completo.

il DNA ottenuto è detto ricombinante, poiché è costituito da DNA di diversa provenienza. Le due estremità appiccicose sono spesso palindrome.

(L’esistenza della ligasi fu dimostrata nel 1973 da Cohen e Boyer. L’esperimento consisteva nell’estrazione di DNA da due cellule, una resistente a X e una a Y. Poi il DNA delle due veniva inserito in una cellula, e questa diventava resistente sia a X che a Y.)

Frammenti di restrizione sono parti di uno stesso filamento di DNA che si ottengono se vengono usati più enzimi di restrizione su uno stesso DNA. Per studiare meglio questi frammenti, sono disegnate mappe di restrizione, in cui si vedono i punti di taglio dei vari enzimi.

I frammenti sono anche studiati tramite elettroforesi, che rende possibile dividere i frammenti per dimensione.

In cosa consiste? C’è uno strato di gel in cui sono presenti tani buchi, detti pozzetti. Lo strato di gel è compreso tra due elettrodi. Nei pozzetti viene inserita la sostanza in cui c’è il DNA da separare. Quando accendo la corrente, il DNA si sposta nel gel, che è formato da tante fibre intrecciate.

Lo spostamento del DNA avviene perché esso è carico negativamente per i gruppi fosfati PO ^—presenti nei nucleotidi. I frammenti di restrizione più lunghi faranno più fatica ad attraversare il groviglio di fibre, quindi saranno più lenti. In questo modo i frammenti più piccoli si differenziano da quelli più grandi.

Il DNA fingerprinting è l’impronta genetica, fatta con mappe di restrizione, ha diversi usi (es. paternità, criminologia, attribuzione di una certa specie ecc). serve quindi a riconoscere la persona a cui un certo DNA appartiene. Il DNA fingerprinting è diverso da persona a persona grazie al DNA RIPETITIVO, che dà POLIMORFISMO DI LUNGHEZZA. Infatti se uso uno stesso enzima di restrizione su DNA diversi, ottengo filamenti di diversa lunghezza. Questo perché ci sono sequenze ripetitive, che non codificano, che si trovano tra due geni e causano la diversità nella lunghezza dei filamenti. Le sequenze che si ripetono si chiamano microsatelliti (fino a 10 basi azotate) o minisatelliti (100 basi). Queste sequenze ripetitive sono ereditarie.

La diversità dovuta alla variazione di lunghezza di parti del DNA, permette di riconoscere a chi appartiene un certo DNA. Si preferisce confrontare le sequenze ripetitive sono ‘più comode’ per confrontare i DNA perché non si deve analizzare tutto il filamento, ma solo loci scelti, mentre con i geni dovrei analizzarli tutti.

GENOTECA: è una cultura batterica in cui i batteri hanno pezzi diversi di un DNA iniziale di una cellula. Ogni cellula batterica avrà un gene diverso di questo DNA. (per ottenere i diversi filamenti, taglio con più enzimi di restrizione).

Nella cultura c’è quindi un miscuglio di più plasmidi diversi : per riconoscerne uno uso delle SONDE cioè delle sequenze polinucleotidiche complementari a quelle del plasmide che mi interessa (di cui so la sequenza). Rendo queste sonde radioattive, così che quando si legano al plasmide, questo viene marcato e diventa fluorescente, così lo posso identificare.